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ELISA試劑盒在酶標包被板上設規范品孔10孔，在、第二孔平別離加規范品100μl，然后在、第二孔中加規范品稀釋液50μl，混勻；
然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl別離加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平別離加規范品稀釋液50ul，混勻；
加樣：別離設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其他各步操作一樣）、待測樣品孔。
混勻后從第五、第六孔中各取50μl別離加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔平別離加規范品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔平別離取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔別離加規范品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。
（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度別離為30ng/L，20ng/L ，10ng/L，5ng/L， 2.5ng/L）。
在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，ELISA試劑盒然后再加待測樣品10μl（樣品終究稀釋度為5倍）。
ELISA試劑盒洗刷：當心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗刷液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
加酶：每孔參加酶標試劑50μl，空白孔除外。
加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，悄悄晃動混勻。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
配液：將20倍濃縮洗刷液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
然后從孔、第二孔中各取100μl別離加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔別離加規范品稀釋液50μl，ELISA試劑盒混勻；
溫育：操作同3。
停止：每孔加停止液50μl，停止反響（此時藍色立轉）。
ELISA試劑盒測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加停止液后15分鐘以內進行。
洗刷：操作同5。
ELISA試劑盒顯色：每孔先參加顯色劑A50μl，再參加顯色劑B50μl，悄悄震動混勻，37℃避光顯色15分鐘。